利用顯微鏡推動發育生物學、細胞信號轉導、衰老和神經科學與elegans（線蟲）的發展

本指南概述了可以高效進行線蟲研究的顯微鏡技術。線蟲是一種廣泛使用的模式生物，與人類有大約70%的基因同源性，是研究發育、神經科學、遺傳學和衰老的理想生物。它的透明性和易培育性使其成為一個出色的遺傳學模型系統。它可以進行高分辨率成像。主要的實驗方法包括揀蟲、轉基因、熒光篩選、成像和記錄。

顯微鏡和線蟲研究

顯微鏡是研究線蟲的工具。在這些步驟中都會用到它們：

1、“揀蟲"：用金屬挑針從瓊脂平板上挑出蟲子，轉移到新的平板上進行培養或實驗。

2、通過向線蟲體內顯微注射核酸進行轉基因（基因改造）。

3、熒光篩選，鑒定表達轉染熒光蛋白的轉基因線蟲。

4、在實驗過程中對線蟲（從胚胎到成蟲的所有階段）進行成像和記錄。

這些任務通過體視顯微鏡、復合顯微鏡或共聚焦顯微鏡來完成。

來自秀麗隱桿線蟲的細胞表達熒光蛋白SPD5-GFP（指示中心體標記，綠色）和Histon 2B-Cherry（指示細胞核，紅色）。間期細胞中的兩對中心體用白色箭頭標出。該圖像是經過ICC（即時計算去噪）和SVCC（小體積計算去噪）處理后的Z-stack的最大投影。

揀蟲

要“挑選"具有適當表型或轉基因的個體秀麗隱桿線蟲，或將線蟲從一個平板移到另一個平板，研究人員需要使用立體顯微鏡和一個末端帶有金屬的小工具。

與揀蟲有關的挑戰有：

1. 對比度不夠好時，難以識別線蟲的關鍵解剖細節。

2. 長時間揀蟲會造成用戶疲勞。

3. 用工具處理線蟲時，顯微鏡物鏡下沒有足夠的空間。

4. 視野不夠大時，找蟲子很麻煩。

不過，徠卡顯微鏡具有以下優勢，可以克服這些挑戰：

1. 配備各種對比方法的透射光底座可實現高光學對比度，從而觀察到蟲體細節。

2. 采用人體工程學模塊，用戶安裝舒適，減少勞累和疲勞。

3. 物鏡下方空間充足，工作距離可達122毫米。

4. 視野更大，更容易發現線蟲。

瓊脂板上有很多秀麗隱桿線蟲，就像在挑蟲時可能會看到的那樣。

顯微注射轉基因

秀麗隱桿線蟲的轉基因通常是通過核酸顯微注射完成的。顯微注射通常使用配有注射裝置的倒置復合顯微鏡進行。

對線蟲進行顯微注射面臨著一些挑戰：

1. 對比度不足，無法觀察到線蟲的精細解剖細節，而這正是進行適當靶向定位所必需的。

2. 沒有足夠的空間使用微型注射器。

3. 設置不穩定時振動太大。

為了克服這些挑戰，用戶可以利用徠卡顯微鏡提供的優勢：

1. 光學對比方法，如DIC（微分干涉對比）或IMC（集成調制對比），可清楚地看到注入線蟲的位置。

2. 抗震裝置（防震裝置）穩定可靠。

能夠使用精確的操作器（Narishige或Eppendorf）進行微量注射。

3. 表達GFP（綠色熒光蛋白）的轉基因秀麗隱桿線蟲。Thunder的圖像由中南大學生命科學學院的L. Ma提供。

熒光篩選

要找到轉基因成功的秀麗隱桿線蟲，需要使用立體顯微鏡進行熒光篩選。

線蟲熒光篩選存在一定的挑戰：

1. 熒光信號暗淡，難以觀察熒光轉基因。

2. 老線蟲蟲和瓊脂發出強烈的自發熒光。

3. 由于視野較小，難以發現線蟲，導致篩查時間延長。

使用徠卡顯微鏡可以通過以下方式克服這些篩選難題：

1. 采用三光束技術的獨立激發通道提高了信噪比，適用于體視顯微鏡。

2. 使用專門設計的反射鏡防止自發熒光，反射鏡可與Leica透射光底座一起使用。

3. 徠卡透射光底座提供大視場和多種對比方法。

一張成年雌雄同體秀麗隱桿線蟲的Thunder拍攝的圖像，展示了其性腺。該線蟲用以下熒光染料進行了染色：DAPI（藍色）指示細胞核，SP56（綠色）指示精子，RME-2（紅色）指示卵母細胞，PGL-1（洋紅色）指示RNA和蛋白質顆粒。圖片由德國哈勒馬丁路德大學的C. Eckmann提供。

成像和文件

在篩選和鑒定轉基因秀麗隱桿線蟲標本后，高分辨率成像和精確記錄對實驗數據分析至關重要。要實現這一目標，需要顯微鏡配備高質量的攝像頭或探測器以及兼容的成像軟件。

線蟲成像和記錄方面的主要挑戰是：

1. 由于光散射的原因，在對線蟲更深處的結構成像時會出現焦外模糊的現象。

2. 避免光和熱對線蟲造成傷害。

3. 利用基因編碼報告器觀察活體線蟲的暗淡熒光（包括延時成像）。

使用徠卡顯微鏡可以克服這些挑戰。優勢如下：

1. 利用圖像增強功能，將線蟲深處的細節可視化。

2. 使用高質量的光學元件、適當的照明光源和靈敏的相機/探測器，減少光照射，降低對線蟲的傷害。

3. 利用寬場顯微鏡和高靈敏度顯微攝像機的良好單噪比，促進實時成像。

4. 必要時，使用轉盤、共聚焦或光片顯微鏡獲取更高分辨率的三維圖像。

研究秀麗隱桿線蟲的神經系統：使用徠卡共聚焦顯微鏡拍攝的表達熒光蛋白CFP（青色）、GFP（綠色）、YFP（黃色）和DsRed（紅色）的線蟲圖像。

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